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流式細胞術固定透化解決方案

更新時間:2024-12-06

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流式細胞術(FlowCytometry)是一種用于分析細胞群體的實驗技術,能夠同時分析單個細胞的多個特性。為了提高檢測的靈敏度和準確性,細胞通常需要經過固定(Fixation)和透化(Permeabilization)處理,以便檢測細胞內的分子(如蛋白質、DNA、RNA等)。下面是流式細胞術中固定和透化的常見解決方案。  
一、固定(Fixation)  
固定的目的是保持細胞內的結構和分子狀態(tài),防止細胞在實驗過程中發(fā)生變化,通常使用化學固定劑進行處理。  
常用的固定劑:  
甲醛(Formaldehyde)  
常用濃度:1-4%  
作用:甲醛能夠通過與細胞內的蛋白質交聯(lián),固定細胞的結構。它對細胞膜和細胞內部結構具有較強的穿透性,常用于維持細胞形態(tài)和免疫標記物的穩(wěn)定性。  
使用方法:  
將細胞懸浮液與適量甲醛溶液混合。  
4°C保存固定的細胞,避免固定時間過長,通常固定時間為15-30分鐘。  
固定后的細胞可用PBS洗滌,并根據需要進行透化處理。  
乙醇(Ethanol)  
常用濃度:70%(體積分數(shù))  
作用:乙醇是一種廣泛使用的固定劑,適合固定DNA、RNA等分子,并能固定細胞形態(tài)。乙醇的優(yōu)勢在于其良好的穿透性和與細胞膜的作用方式,可以同時破壞細胞膜,適用于之后的透化步驟。  
使用方法:  
細胞懸浮液加入70%乙醇,輕輕混勻。  
在-20°C或4°C保存固定的細胞,常見的固定時間為30分鐘到1小時。  
固定后的細胞可用PBS洗滌,并進行透化處理。  
固定后注意事項:  
固定細胞后需要盡快進行透化處理,避免固定過度導致標記失效。  
固定過程中要保持溫度低(4°C)以減少細胞損傷。  
固定劑的濃度和時間對流式細胞術結果有很大影響,需要優(yōu)化。  
二、透化(Permeabilization)  
透化的目的是使細胞膜或細胞內的膜結構變得可滲透,從而使抗體或探針能夠進入細胞內部,標記細胞內的分子。  
常用的透化劑:  
TritonX-100  
濃度:0.1%-0.5%  
作用:TritonX-100是一種非離子表面活性劑,能夠有效地破壞細胞膜,使抗體能夠進入細胞。它對細胞膜有較強的破壞作用,可以透化大多數(shù)細胞類型。  
使用方法:  
固定后的細胞加入0.1%-0.5%TritonX-100溶液,輕輕混勻。  
在室溫下孵育10-20分鐘,或根據實驗需要優(yōu)化透化時間。  
孵育后,細胞用PBS洗滌,去除透化劑。  
Saponin  
濃度:0.05%-0.1%  
作用:Saponin是一種植物來源的透化劑,作用較為溫和,常用于細胞內標記物的檢測,特別是在對細胞膜破壞較為敏感的實驗中。它通過選擇性地破壞細胞膜的膽固醇組成,打開細胞膜上的孔隙。  
使用方法:  
固定后的細胞加入0.05%-0.1%Saponin溶液。  
在室溫下孵育5-10分鐘,透化效果較溫和。  
孵育后,用PBS洗滌細胞。  
Methanol(甲醇)  
濃度:100%  
作用:甲醇是一種常見的透化劑,特別適用于細胞內蛋白的檢測。它通過抽提細胞內的脂質成分,從而使抗體能夠進入細胞。甲醇透化較強,但有可能破壞細胞內的某些結構,因此通常用于固定后透化。  
使用方法:  
固定后的細胞加入冷卻的100%甲醇。  
在-20°C保存30分鐘或更長時間。  
完成透化后,用PBS洗滌。  
透化后注意事項:  
透化時間和濃度過長可能會導致細胞膜或細胞內部結構的過度破壞,影響實驗結果。  
不同細胞類型對透化劑的反應不同,可能需要優(yōu)化透化條件。  
透化和固定處理后,應盡量避免長時間暴露在室溫下,避免細胞損傷。  
三、固定與透化的綜合流程  
細胞培養(yǎng)與收集  
收集待檢測的細胞,使用PBS洗滌去除培養(yǎng)基。  
固定處理  
根據實驗需要選擇固定劑(如甲醛、乙醇等)。  
按照推薦的濃度和時間對細胞進行固定。  
固定后使用PBS洗滌細胞。  
透化處理  
根據實驗要求選擇透化劑(如TritonX-100、Saponin、Methanol等)。  
按照推薦濃度和時間對細胞進行透化。  
透化后用PBS洗滌細胞,去除透化劑。  
抗體染色與檢測  
固定和透化后的細胞可以進行表面標記或內部分子標記。  
使用適當?shù)臒晒鈽擞浛贵w,進行流式細胞術分析。  
四、總結  
在流式細胞術中,細胞固定和透化是兩個非常關鍵的步驟。固定劑能夠保持細胞結構并防止分子降解,而透化劑能夠使抗體或其他探針進入細胞,標記內部分子。選擇適當?shù)墓潭ê屯富瘲l件對于確保實驗的準確性和重復性至關重要。因此,建議根據細胞類型、實驗目標和抗體性質來優(yōu)化固定和透化的方案。
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